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如何分离纯化、鉴定外泌体

外泌体的分离纯化、鉴定如何分离纯化、鉴定外泌体

      外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm),现今,其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年,外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现, 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体,且外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体被视为特异性分泌的膜泡,参与细胞间通讯,对外泌体的研究兴趣日益增长,无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

 
一、分离:
超速离心法:
        超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。据不完全统计,约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。该方法由几个离心步骤组成,可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡,沉淀外泌体(如图所示)。但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低,且重复离心操作有可能对外泌体造成损害,从而降低其质量。
 
        如将超速离配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体,是公认可以得到最高纯度的分离方法。但此法对离心时间非常敏感,一般需要8-30h,产率较低,同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离,因此难以广泛普及。
 
 
聚合物沉淀法:
        第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了,最常见的聚合物是聚乙二醇(PEG)。通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合,4℃温育,低速离心,沉淀外泌体(如图所示)。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒,比如图中的ExoQuick™(System Biosciences)。这类试剂盒使用容易和快速,不需要额外的设备,且随着产品不断更新换代,提取效率和纯化效果逐渐提高,因而逐渐取代超速离心法并推广开来。沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。不过大家不用担心,一般来说这些物质不会干扰下游分析,使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。


 
二、鉴定
        外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。如果大家看过外泌体研究相关的文献,就肯定对一张图印象深刻。


 
        不错,想发外泌体文章,光找到高效率的分离方法还不够,要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。

鉴定方式不外乎就是下面这三种:1. 形态学(电镜);2. 粒子大小(径粒分析);3. 标志蛋白(WB)。

综合来说,透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等,属于鉴定方法中的金标准,其他两种方式则常常作为辅助使用。
 
三、得到了外泌体之后如何做?
        外泌体携带大量功能性的miRNA,少量的mRNA、lncRNA,以及特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)等生物活性物质,在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程,与多种疾病的发生和进程密切相关。对外泌体验明正身之后,就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行检测和深入分析了。


         由于外泌体中含有较多降解的短RNA片段,测序时会成为背景干扰有效数据,通常都建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。而对于lncRNA来说,大部分在细胞内低表达,在外泌体中丰度就更低了,对于低丰度基因,芯片检测的准确性远远大于测序,因此也建议使用基因芯片的方法检测外泌体lncRNA。


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